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海南地不容 Stephania hainanensis Lo et Y. Tsoong cambodiana Pierre ex Gagn.

门：被子植物门Angiospermae
亚纲：原始花被亚纲 Archichlamydeae
科：防己科 Menispermaceae
种：海南地不容

纲：双子叶植物纲 Dicotyledoneae
目：毛茛目 Ranales
属：千金藤属 Stephania

海南地不容是多年生藤本。块根球形或不规则球形，露于地面。

1、分布范围及现状
3、生长习性
5、DNA提取方法
7、储藏信息

2、形态特征
4、主要价值
6、遗传多样性特征

1 分布范围及现状

特产海南。分布于海南省白沙、琼中、儋县等地。

群落的主要植物组成：海南地不容在郁闭度高的山坡及郁闭度低的山顶均有分布。伴生植物中，乔木层植物有刺桑、海南大风子（Hydnocarpus hainanensis）、龙眼（Dimocarpus longan）、假轮生水柳（Homonoia pseudoverticillata）、黄桐（Endospermum chinense）、染木树（Saprosma ternatum）等。灌木层主要有翼叶九里香、绿背桂花、喜光花（Actephila merrilliana）、异木患（Allophylus viridis）、银叶巴豆（Croton cascarilloides）等。

按照块根大小，将其分为三个等级：Ⅰ级：块根直径20cm以上，重量5kg以上；Ⅱ级：块根直径10-20cm，重量1-5kg；Ⅲ级：块根直径小于10cm，重量少于1kg。调查发现海南地不容的大龄植株大多被认为采挖，剩余的多为中、小龄植株，情况不容乐观。

2 形态特征

藤本，老枝稍木质化，枝、叶含淡黄色或白色液汁，全株无毛；枝粗壮，有直沟槽。叶薄纸质，三角状圆形，长和宽均约10-16厘米，有时较小，顶端短渐尖，基部圆至近截平，边浅波状，或疏生角状粗齿，或近全缘；掌状脉通常10-11条，3条向上，2条近平伸，5-6条向下，网状小脉上有清晰的小乳突；叶柄粗壮，通常与叶近等长或稍短。雄花序为复伞形聚伞花序，常几个生于一腋生、无叶、屈曲的短枝上，总梗长3-7厘米，伞梗3-5个，长2-4.5厘米，小聚伞花序有花3-5朵；小苞片狭披针形；花梗长1-3毫米；雄花：萼片黄绿，通常6，很少8，外轮匙状楔形，长2.5毫米，内轮稍阔；花瓣3，很少4，橙黄色，长1.5-2毫米，宽2-2.5毫米，其中1片常深凹；聚药雄蕊柱长约1毫米；雌花序紧密呈头状，总梗长2.5-5厘米，上端明显膨大，雌花：花被左右对称；萼片1，近卵形，长约0.4毫米；花瓣2，肉质，阔卵形至贝壳状，比萼片稍大。

核果红色，阔倒卵圆形，果梗稍肉质；果核长约1厘米，宽约8毫米，背部有4行钩刺状雕纹，每行约20颗；胎座迹穿孔。

3 生长习性

海南地不容主要分布于干旱的石灰岩地区，海拔400-800m。此外，在花岗岩山地也有少量分布。土壤类型为积存于石缝中的腐殖土或沙壤土。

4 主要价值

具有止痛，消肿解毒之功效。常用于胃痛，外伤疼痛，疮疖痈肿。

5 DNA提取方法

采用试剂盒法进行。称取约30mg（或50mg）叶子标本，放入离心管，加钢珠，充分研磨成粉末。于装有研磨好粉末的离心管中，加入700ul 65℃预热缓冲液GP1（或加巯基），迅速混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混匀样品数次。加入700ul 氯仿，颠倒充分混匀，12000rpm（~13400g），离心5min。取上400ul清液转入新的离心管中，加入700µl缓冲液GP2，再次颠倒充分混匀。将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm(~13400g)，离心1min，弃除下部废液。（分两次进行）向吸附柱CB3加入500ul缓冲液GD，12000rpm（~13400g），离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3加入600ul漂洗液PW，12000rpm（~13400g），离心1min，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复上一操作步骤。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（~13400g），离心2min，倒掉废液。将吸附柱移到新的离心管，打开吸附柱CB3盖子，置温室放置数分钟，以彻底晾干残留的漂洗液，无乙醇味即可。悬空加入50ulDDH2O，静止3min，12000rpm（~13400g），离心2min。将离心管底的50ul DDH2O抽出，再次加入吸附柱CB3，12000rpm （~13400g），离心2min。放入冰箱，备用。

DNA浓度与纯度的检测：量取23mlTAE溶液于三角瓶中，称取20mg琼脂糖溶于TAE溶液中，配制浓度为1%的胶。将三角瓶放在微波炉中加热，待琼脂糖全部溶解，取出三角瓶，于制胶板加入0.5µl Golden view核酸染料，倒入琼脂糖溶液，待自然冷却将制好的胶放入电泳槽中，使缓冲液刚好超过凝胶面约2mm。向点样孔中加入2µl 的Marker。将1µl Loading Buffer 与2µl DNA 混匀，将其点入点样孔中。同样方法进行其他点样。在120V电压，400mA电流下电泳30min。将胶从胶板上取出，放在在紫外透射仪下进行质量检测拍照。用紫外分光光度计测量DNA的含量和质量时要用溶解DNA的TE作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm和230nm吸收值，记录A260/A230和A260/A280的比值，并记录下核酸的含量。当A260/A280值介于1.6～1.9之间，且A260/A230值≥2，则为合格的DNA浓度。

6 遗传多样性特性

高通量转录组分析和SSR遗传多样性分析：提取块根部分的总RNA供高通量转录组分析实验，提取各个居群样品的叶片DNA供遗传多样性分析实验。以海南地不容块根为实验材料提取总RNA，检测RNA提取质量，反转录生成cDNA后构建高通量测序文库。利用高通量测序技术对文库进行序列读取，之后使用生物信息学软件对原始数据进行拼接。对海南地不容块根转录组数据进行注释和分析：原始数据经拼接之后，进行下一步的基因注释和分类。在NCBI（美国国立生物技术信息中心）的非冗余（non-redundent，nr）蛋白库中通过BLASTX进行比对。之后采用InterProScan和Blast2GO进行Unigene的GO（Gene Ontology）注释。根据KEGG ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因与基因组百科全书)注释进一步得到Unigene的代谢路径注释。之后还可通过COG（clusters of orthologous group，直系同源聚类分析）注释未知蛋白序列。基于海南地不容块根转录组数据的序列信息，利用生物信息学软件开发SSR分子标记引物。于SSR分子标记的药材海南地不容的遗传多样性分析：对所获得的SSR分子标记引物，用琼脂糖凝胶电泳进行预检测，选取扩增较好、多态性高的SSR引物，采用SSR荧光标记毛细管电泳法，分析海南地不容不同居群的遗传多样性。

第1次SSR引物筛选共筛选9对引物，一些引物之间的Tm值相差较大，使用Touch Down PCR进行扩增。PCR扩增条件及体系见图。结果发现9对引物都不能扩增出正常条带（100~300左右），引物的扩增效率不高。